Key Points for the Isolation and Culture of Endothelial Cells: Avoiding Pitfalls with Precision

Endothelial cells are a single layer of squamous epithelial cells that form the inner lining of blood vessels. They are polygonal in shape, with interdigitating edges that interlock with adjacent cells. These cells cover the inner surfaces of arteries, veins, and capillaries, creating a mechanical barrier between the blood and the surrounding tissues. As essential components of the vascular system, endothelial cells are widely used in basic research, disease modeling, clinical diagnosis, and drug screening.

In this issue of the Cell Culture Academy, we will provide you with a detailed introduction to the structure, functions, and procedures involved in the isolation and culture of endothelial cells. This will help you gain a clear understanding of endothelial cells and conduct related experiments effectively.

I. Modular Distribution of Endothelial Cell Types

Endothelial cells are heterogeneous and differentiate into distinct subtypes based on vascular function and tissue-specific requirements, resulting in specialized distribution patterns across the body.

1. Continuous Endothelium

Structural Characteristics

The basement membrane is continuous, and the cells form a highly selective barrier through tight junctions involving proteins such as claudins and occludins. Lipid-soluble small molecules can diffuse freely, while hydrophilic molecules and water depend on specific transport systems—such as aquaporins-to cross the barrier.
Cell-to-cell connections are exceptionally tight, with intercellular gaps measuring approximately 12 angstroms (Å). Most macromolecular transport occurs via transcellular pathways, including vesicle-mediated transport of albumin.
These endothelial cells exhibit weak contractility and contain a relatively sparse distribution of cytoskeletal actin, which helps maintain their stable morphology and contributes to their extremely low permeability.

Function

Continuous endothelium plays a critical role in maintaining the structural and functional integrity of the blood-brain barrier (BBB) and blood-retinal barrier, shielding the central nervous system from harmful substances.

Typical Distribution

Commonly found in the brain (blood-brain barrier), heart, lungs, skeletal muscles, and skin.

2. Fenestrated Endothelium

Structural Features

The endothelial surface contains numerous fenestrations, typically ranging from approximately 200 to 1,000 angstroms (Å) in diameter. Most of these fenestrae are covered by non-membranous diaphragms composed of PV-1 protein. These structures significantly enhance the permeability of the endothelium to fluids and solutes while limiting the passage of larger macromolecules.
The basement membrane remains continuous, supporting the rapid exchange of small molecules and fluids.
The glycocalyx layer on fenestrated endothelial surfaces is relatively sparse, although residual structures may still contribute to the regulation of the local microenvironment and selective solute transport.

Functions

Fenestrated endothelium facilitates efficient filtration (e.g., in the glomerulus), hormone secretion (e.g., in islet capillaries), and nutrient absorption (e.g., in the gastrointestinal mucosa).

Primary Distribution

Kidneys (glomeruli), endocrine glands (e.g., pancreatic islets), and the gastrointestinal mucosa.

3. Discontinuous / Sinusoidal Endothelium

Structural Characteristics

The basement membrane is either discontinuous or entirely absent, and large intercellular gaps ranging from 0.1 to 1 μm allow the passage of macromolecules (e.g., lipoproteins) and blood cells into the underlying parenchymal tissue.
Intercellular junctions are relatively loose, permitting dynamic regulation of vascular pore size in response to local signals such as immune mediators and mechanical stress. This structure supports specialized filtration and exchange functions.

Function

This highly permeable endothelial subtype facilitates the exchange of macromolecules and blood cells and plays a key role in immune surveillance, clearance, and regulation—particularly in the liver and other filtering organs.

Primary Distribution

Commonly found in the sinusoidal vascular beds of the liver, spleen, and bone marrow.

II. Endothelial Cell Functional Modular System

Endothelial cells in different tissues adapt to their specific physiological demands by adjusting the composition and proportion of their intercellular connections, thereby maintaining proper vascular system function.

1. Types of Cell Connections

Tight Junctions

Tight junctions are formed by transmembrane proteins such as Occludin and claudins, anchored to the cytoskeleton by proteins like ZO-1. They create a selective barrier that restricts passive diffusion of solutes through the spaces between cells. Tight junctions play a crucial role in specialized barriers such as the blood-brain barrier.

Gap Junctions

Gap junctions consist of connexin proteins and enable direct transfer of ions, small molecules, and second messengers between adjacent cells. This facilitates rapid coordination of cellular activities, including the synchronized propagation of calcium signals and metabolite exchange.

Adherens Junctions

Adherens junctions rely on cadherins—such as VE-cadherin—that connect to the actin cytoskeleton to maintain mechanical stability between endothelial cells. They also participate in leukocyte adhesion and transendothelial migration.

2. Molecular Biomarkers

3. Functional Response

Material Exchange Function

All types of endothelial cells participate in the exchange of oxygen, nutrients, and metabolic waste. Depending on their structure, they utilize transcellular or paracellular pathways. For example, continuous endothelial cells primarily rely on transcellular mechanisms (such as vesicle-mediated transport) for material exchange.

Mechanical Responsiveness

Shear stress can activate endothelial nitric oxide synthase (eNOS), promoting the release of nitric oxide (NO) to dilate blood vessels and maintain hemodynamic stability. Stable pulsatile blood flow can inhibit the expression of inflammatory factors, preventing endothelial activation and dysfunction.

Pathological Plasticity

Under pathological conditions such as oxidative stress and inflammation, endothelial cells can develop dysfunction, manifested as increased permeability and upregulation of adhesion molecule expression. These changes are involved in various pathological processes, including atherosclerosis and diabetic vascular complications.

Unity in Heterogeneity

Despite significant structural and functional differences among endothelial cells in different tissues and organs, they universally express some common markers (e.g., CD31, VE-cadherin), demonstrating a certain degree of unity. Endothelial cells exhibit polarity, with the apical side facing the blood lumen and the basal side binding to the basement membrane through receptors such as integrins, thereby maintaining vascular structural integrity.

III.  Endothelial Cell Isolation and Culture

Using the isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) as an example, the Protocol is outlined as follows:

1. Vessel Preparation

Umbilical Cord Collection and Cleaning: Collect a fresh umbilical cord and rinse thoroughly with sterile PBS to remove surface blood.

Vessel Identification and Dissection: Longitudinally cut the umbilical cord to locate the umbilical vein—distinguished by its larger diameter and thinner wall compared to the two smaller, spirally arranged arteries. Use blunt dissection with forceps to carefully remove surrounding connective tissue.

Vessel Flushing and Sealing: To eliminate residual red blood cells and clots that may interfere with downstream procedures, flush the vessel repeatedly (typically five to eight times) with cold PBS until the effluent runs clear. Seal one end of the vessel with a sterile surgical clip and attach a syringe to the other end to create a closed system for controlled enzymatic treatment.

2. Digestion and Collection

Slowly inject the HUVEC specific digestion enzyme into the vessel, ensuring the lumen is completely filled.
Incubate the vessel at 37 ℃ for 10-15 min.
Following digestion, to avoid blockage of the outflow, first use a blunt needle to clear the lower outlet of the vessel.
Next, remove the lower surgical clamp to allow the digestion solution to drain into a 50 mL sterile centrifuge tube containing endothelial cell complete medium.
Rinse the vessel lumen with the same complete medium and collect the resulting eluate.
Centrifuge the collected solution at 150 ×g for 5 min.
After centrifugation, endothelial cells will be concentrated at the bottom of the tube.
Carefully discard the supernatant without disturbing the cell pellet.

3. Seeding and Culture

Resuspend the cells in complete medium and seed them into culture flasks pre-coated with fibronectin, gelatin, or basement membrane matrix to promote endothelial cell adhesion and spreading. After 24-48 h of incubation, assess cell attachment. Following a medium change, endothelial cells typically exhibit a characteristic flattened monolayer morphology.

4. Common Questions and Solutions

References

[1] Ricard N, Bailly S, Guignabert C, Simons M. The quiescent endothelium: signalling pathways regulating organ-specific endothelial normalcy. Nature Reviews Cardiology. 2021;18(8):565-580.

[2] Trimm E, Red-Horse K. Vascular endothelial cell development and diversity. Nature Reviews Cardiology. 2023;20(3):197-210.